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促紅細胞生成素是一種糖蛋白激素，更準確地說是細胞因子，是紅細胞生成的主要調節劑，它刺激晚期前體細胞形成紅細胞，並根據氧氣攝入量增加骨髓網織紅細胞的產量。只要組織氧合不受損，促紅細胞生成素的濃度以及循環紅細胞的數量就會保持不變。促紅細胞生成素的產生在基因轉錄水平受到調節，並且由於增加合成促紅細胞生成素的細胞數量的唯一生理誘因是缺氧，促紅細胞生成素的產生和代謝均不取決於其在血漿中的濃度。一個健康人體內大約有2.3*10^13個紅細胞，平均壽命為120天。因此，體內的紅細胞池應以每秒約 2.3 個細胞的速度不斷更新。應嚴格調節紅細胞分化系統，以在正常條件下維持恆定的循環紅細胞水平。此外，該系統應該對體內氧氣含量的變化高度敏感。目前，有大量證據表明，控制紅細胞範圍細胞分化的關鍵因素是血液中循環的促紅細胞生成素。
促紅細胞生成素是一種極其活躍的激素，在體內以皮摩爾濃度起作用。其在血液中濃度的微小波動會導致紅細胞生成速率發生顯著變化，其正常濃度範圍可達 4 至 26 IU/l。因此，直到血紅蛋白的濃度低於105g/l，促紅細胞生成素的濃度才不會超出這個範圍，不可能檢測到它的增加（除非你知道它的初始值）。紅細胞增多症通過負反饋機制抑制促紅細胞生成素的產生。這不僅是由於循環紅細胞數量增加導致向組織輸送的氧氣增加，而且還因為血液粘度增加。對於運動員來說，這意味著在引入外源性和違反紅細胞生成調節機制期間其自身激素的產生減少。因此，在運動中使用促紅細胞生成素作為興奮劑時，運動員應該考慮到體內紅細胞生成的未來。
興奮劑檢測
通常，紅細胞生成素存在於尿液或血液樣本中。血液比尿液更容易被檢測到。半衰期為 5-9 小時，即檢測概率在 2-3 天后顯著降低。
肝素用作掩蔽劑。還使用通過導管將蛋白酶注射到膀胱中。
促紅細胞生成素的生理作用
長期以來，細胞產生促紅細胞生成素的問題仍然懸而未決。這主要是由於缺乏識別合成激素的細胞的直接方法。細胞鑑定是通過間接方法進行的，包括組織培養物在體外合成產品的能力。據信，產生EPO的細胞作用的主要候選者是腎小球細胞和腎小管近端部分的細胞。紅細胞生成素基因的克隆，以及原位雜交方法的發展，允許直接識別那些發生某些基因表達的細胞，改變了合成紅細胞生成素的細胞性質的想法。原位雜交顯示合成促紅細胞生成素 mRNA 的細胞不是腎小球或腎小管。顯然，腎臟中EPO合成的主要場所是間質細胞或毛細血管內皮細胞。如前所述，缺氧是調節 EPO 產生的主要因素。在缺氧條件下，血漿中循環的 EPO 數量增加約 1000 倍，達到 5-30 單位/毫升。對離體腎臟進行的大量實驗表明，它包含對氧氣濃度變化做出反應的傳感器。
早在 1987 年，J. Schuster 和他的同事就研究了促紅細胞生成素產物響應缺氧的動力學。結果表明，在缺氧建立後約1小時，腎臟中促紅細胞生成素mRNA的量增加，並且mRNA繼續積累4小時。當缺氧解除時，EPO mRNA 的水平迅速下降。促紅細胞生成素特異性抗體檢測到的血漿和腎促紅細胞生成素量的變化與具有相應滯後期的 mRNA 量的變化嚴格平行。在這項研究中獲得的結果表明，在此期間刺激了 EPO 的從頭產生。
在 S 實驗室。 Konry 於 1989 年通過在腎皮質組織切片上原位雜交的方法研究了誘導 EPO 合成的過程。發現在貧血狀態下，EPO的產生顯著增加，但與EPO mRNA在單個細胞中的雜交強度保持不變。表明EPO產量的增加與合成激素的細胞數量的增加有關。隨著正常血細胞比容的恢復，促紅細胞生成素合成細胞的數量迅速減少，變化的動力學與 mRNA EPO 和循環激素數量減少的動力學相關。組織學分析數據表明，EPO 是由腎臟皮質部分的間質細胞合成的。
表明成人血漿促紅細胞生成素的 5% 至 15% 是細胞外來源的。如果胚胎中促紅細胞生成素合成的主要場所是肝臟，那麼成年人體內的肝臟也是產生EPO的主要器官，但在腎外。這一結論已在最近檢測各種器官中 mRNA EPO 的實驗中得到證實。顯然，個體發育過程中EPO合成主要場所的變化是一個遺傳決定的事件。
體內促紅細胞生成素的合成由大量生化輔助因子和興奮劑介導。據推測，缺氧會導致腎臟特定感覺細胞的氧含量降低，從而導致結節細胞中前列腺素的產生增加。結果表明，前列腺素在刺激促紅細胞生成素產生中起重要作用。在缺氧的情況下，前列腺素合成抑製劑對 EPO 的產生具有壓倒性的影響。缺氧條件下前列腺素生物合成的主要貢獻可能是環氧合酶系統。在缺氧時（以及在引入鈷離子時），腎臟中會釋放中性蛋白酶和溶酶體水解酶，正如已經證明的那樣，這也會刺激 EPO 的產生。溶酶體酶的釋放似乎與 cGMF 產量的增加有關。結果表明，溶酶體酶被蛋白激酶激活，而蛋白激酶又被 cAMP 激活。
在缺氧條件下，觀察到磷脂酶 A2 活性的誘導，這導致花生四烯酸水平增加，在環加氧酶的參與下轉變成內過氧化物。已經註意到缺氧是環氧合酶活性的最佳條件。鈣系統可能在這些生化事件中發揮重要作用：鈣離子刺激磷脂酶 A 的活性和前列腺素的形成。反過來，前列腺素可以誘導腺苷酸環化酶活性並觸發導致磷酸化和水解酶激活的一系列生化事件。水解酶和最終導致 EPO 合成增加的鏈的作用仍不清楚。下丘腦-垂體系統的一些激素、甲狀腺激素和一些類固醇激素也能刺激 EPO 的生物合成。鈷離子是EPO產生的特異性誘導劑，它們對EPO生物合成系統的作用機制尚不清楚。該系統是用於研究 EPO 生物合成誘導的有吸引力的實驗模型。
人促紅細胞生成素分子，其中碳水化合物成分佔分子量的40-50%（糖蛋白的分子量為32-36*10^3 am，蛋白質部分的估計分子量為18 399* 10^3 u)，由 193 個氨基酸殘基組成。歐洲專利局 等電點值低（pH 3.5-4.0），這是由於促紅細胞生成素碳水化合物鏈末端位置存在唾液酸所致。聚丙烯酰胺凝膠中血漿 EPO 的等電聚焦可以揭示幾個分子量相同但等電點大小不同的部分，這證明了激素碳水化合物部分結構的異質性。在神經氨酸酶處理或酸水解過程中去除唾液酸會導致體內激素穩定性喪失，但不影響其體外活性。蛋白質鏈上有四個位點的糖苷殘基，可以代表不同的醣類，因此有幾個品種的EPO具有相同的生物活性，但其理化性質略有不同。
對人類促紅細胞生成素氨基酸序列的分析揭示了三個潛在的 N-糖基化位點，其中包括 Asn-X-Ser/Thr 共有序列。在用 N-糖苷酶處理激素的實驗中，該酶特異性地切除了與 N-糖苷鍵的天冬酰胺殘基相關的寡糖鏈，證實在 EPO 分子中發現了三個 N-糖基化位點。作為對激素 O-糖苷酶加工的實驗結果，發現它還含有通過 O-糖苷鍵與蛋白質部分相關的寡糖鏈。
促紅細胞生成素基因（基因：[07q21/EPO]促紅細胞生成素）由五個外顯子和四個內含子組成。該基因編碼一種由 193 個氨基酸殘基組成的蛋白質。已經鑑定了四種類型的 rnAs 與促紅細胞生成素基因的相互作用，其中兩種在引入氯化鈷後的提取物中存在，其拷貝數比正常提取物中少得多。這些數據表明存在參與促紅細胞生成素基因表達調控的負調控因子（可能是核糖核蛋白）。 EPO 基因表達負調控的假設在 1990 年被 Semenza G. 及其同事證實，他們獲得了一系列編碼人類 EPO 基因和 S 側翼區域各種片段的轉基因小鼠。分析不同轉基因中的基因表達，可以識別人類促紅細胞生成素基因的三個調控元件：
誘導肝臟促紅細胞生成素基因表達所需的正調控元件；
負調控元素；
基因在腎臟中可誘導表達所需的調控元件。
實驗表明，促紅細胞生成素轉錄基因的起始有兩個位點，它們帶有許多起始位點。在正常情況下，轉錄是從位於兩個位點的有限數量的位點開始的。當貧血被誘導或氯化鈷治療時，兩個位點的功能性轉錄起始位點的數量都會增加。在所有情況下，促紅細胞生成素的產生都受到與細胞分離和培養相關的困難、激素產生的不穩定性以及最終其在培養液中的低濃度的限制。
獲得大量高純度 EPO 的一種根本不同的方法與遺傳和細胞工程方法的使用有關。嘗試創造促紅細胞生成素的細菌生產者。大腸桿菌中產生的蛋白質被抗 EPO 的抗體識別，其分子量大約與去糖基化的人 EPO 相對應。已知細菌細胞具有與真核細胞根本不同的糖基化系統。因此，不可能在細菌細胞中獲得正確糖基化的蛋白質。在 EPO 的情況下，獲得正確糖基化的糖蛋白至關重要。因此，在細菌細胞的基礎上產生激素生產者是不合適的。只有在高等動物細胞的基礎上，才能在體外和體內有效生產具有生物活性的促紅細胞生成素。
在重組EPO的性質研究中表明，不完全碳水化合物成分的存在（該系統合成的促紅細胞生成素的分子量等於23*10^3 u）不影響體外激素的活性，但顯著降低其體內活性。同時，在體外試驗中，糖苷酶與碳水化合物的完全分離導致激素生物活性的80%損失。這些數據與現有的觀點相矛盾，即 EPO 的碳水化合物成分對於其體外活性並不是嚴格必需的。
歷史記錄
1989年，通過將中國倉鼠卵巢細胞轉染到人EPO基因組中獲得的重組EPO的結構進行了詳細分析。已經確定，在細胞中合成了兩種類型的 EPO（稱為雙形和四形），它們的 N 結合碳水化合物鏈的支化程度不同。含有較少支鏈碳水化合物成分的 EPO 的雙形式在其生物活性方面與用作標準的天然促紅細胞生成素顯著不同：EPO 的雙形式在體內的生物活性低 7 倍，而在體外 -高出3倍。四型EPO的生物活性與天然EPO非常接近。這些數據表明碳水化合物成分結構在體內促紅細胞生成素的生物活性中的重要作用。顯然，那些含有不完全碳水化合物成分的促紅細胞生成素的體外活性較高與促紅細胞生成素與受體相互作用有關。同時，似乎是碳水化合物成分提供了體內激素的穩定性，因此在體內試驗中提供了高水平的生物活性。
到 1980 年代中期，第一個重組促紅細胞生成素是通過將人類 EPO 基因（定位於人類第 7 條染色體的 11q-12q 區域）導入倉鼠卵巢細胞中獲得的。重組人 p-EPO 通過基因工程（重組）獲得的氨基酸組成與天然人EPO相同。 Recorpone 提供了一種靈活且具有成本效益的有效貧血治療方法，同時具有高安全性和出色的耐受性。由於使用了 recormone，輸血（當今最常見的貧血矯正方法）的需求顯著減少。因此，根據大量研究，使用 recormone 可以恢復血紅蛋白的正常水平，並消除患有貧血症的癌症患者對替代性輸血的需要。同時，這些患者的生活質量有顯著改善；通過輸血治療艾滋病毒和丙型肝炎等病毒性傳染病，在糾正貧血期間存在的感染風險顯著降低。 Recorpone 可用作給藥和指示藥物的方便裝置（筆式註射器）。
同時，糖苷殘基的組成也存在不顯著差異，影響整個激素分子的理化性質。因此，例如，已發現某些類型的促紅細胞生成素的電荷分佈存在某些差異。促紅細胞生成素由各種製藥公司生產，分為五種類型：α、β、延遲（NESP 和 CERA）、θ 和 omega。
Alpha EPO和beta EPO自1988年開始使用。皮下注射時，其生物利用度約為25%，在血液中的最大濃度為12-18小時，半衰期長達24小時（靜脈注射- 5- 6個小時）。促紅細胞生成素延遲劑（NESP 和 CERA）已在過去幾年中使用，並且比其他 EPO 藥物更有效。今天，theta EPO 被認為是最有效、最不致敏、純度最高的。這是因為它是通過人類細胞中的基因工程方法獲得的（一些不道德的運動員和運動醫生認為這使其無法檢測到）。事實上，theta EPO 與人類的相同程度僅為 99%。從倉鼠腎臟中獲得的omega-epo與人體中的其他EPO藥物最不同，因此最容易檢測。僅在東歐和南美銷售。
促紅細胞生成素製劑
來自不同製造商的重組生物仿製藥 a-EPO，即使是歐洲人用醫藥產品委員會 (CHMP) 批准的那些，也可能具有不同的特性、純度，最重要的是，具有不同的生物活性。當對不同的促紅細胞生成素製造商進行分析時，所研究的 12 種產品中有 5 種在三個樣品中的不同系列之間的作用強度存在顯著差異 - 細菌內毒素水平不可接受。
另一項研究是在活性成分（促紅細胞生成素）的含量、強度和異構體組成方面對非歐盟市場上提供的 11 種 EPO 產品（來自八家製造商）進行了比較。體外生物活性範圍為 71-226%，其中 5 個樣品不符合規格。異構體組成的偏差包括：存在一種或多種額外的酸性和/或鹼性異構體，以及不同異構體的數量比發生變化。還確定了系列間的差異；一些產品不符合他們自己的規格，即製造商沒有提供對生產過程的充分控制。活性成分的數量也不總是與規定的數量一致。這種與聲明參數的偏差可能具有重要的臨床意義，因為它們可能導致劑量過量，或者相反，導致劑量降低。所提供的數據清楚地表明在沒有醫學指徵的情況下使用重組促紅細胞生成素存在威脅。
醫療應用
在醫療實踐中，促紅細胞生成素用於治療各種原因的貧血，包括患有慢性腎功能衰竭的癌症患者。如上所述，由於內源性促紅細胞生成素是在體內腎臟中形成的，因此慢性腎功能衰竭患者總是患有貧血症。此外，在以下病理狀況和疾病中觀察到人血漿中 EPO 濃度降低，從而觀察到紅細胞數量減少：
繼發性紅細胞增多症;
自身EPO刺激不足；
良性腎臟疾病（腎積水）；
一般組織缺氧；
腎臟供血障礙
降低環境中的氧氣濃度；
慢性阻塞性肺疾病;
心血管疾病（從右到左）；
血紅蛋白分子結構異常（鐮狀細胞性貧血）；
吸煙對身體一氧化碳的影響；
腎動脈動脈硬化;
排斥移植物；
腎動脈瘤。
在重組促紅細胞生成素出現之前，這些患者定期接受全血和紅細胞塊的輸血。然而，自 1989 年以來，此類程序不再必要，因為它們已被促紅細胞生成素製劑所取代。在某些情況下，其他來源的貧血也可以用重組 EPO 成功治療。事實上，即使在完全完整的內源性 EPO 水平下，重組 EPO 的引入也會誘導額外的紅細胞生成，這一事實被自體獻血者所利用。作為紅細胞大量輸血的替代方法，高劑量 EPO 療法是一種有效的抗貧血措施，可作為治療慢性多發性關節炎、艾滋病、某些腫瘤以及許多外科手術的伴隨療法。高血壓作為重組 EPO 治療用途的副作用的起源尚不清楚。當對患者進行血液透析時，促紅細胞生成素藥物通常是靜脈內給藥。在某些情況下，可以皮下注射相同的藥物。
在促紅細胞生成素的影響下，紅細胞數量的增加，反過來又導致每單位血容量的氧含量增加，從而增加血液的氧容量和向血液輸送氧氣的能力。組織。最終，身體的耐力會增加。在中山的訓練中，當空氣中缺氧導致缺氧狀態時，會產生類似的效果，從而刺激內源性 EPO 的產生。自然，與使用重組藥物相比，缺氧訓練是調節紅細胞生成和改善血紅蛋白氧轉運功能的生理機制，這也是使用EPO作為興奮劑的目的。
由於促紅細胞生成素對組織氧容量和氧運輸的影響，該物質可提高運動表現，主要表現為有氧耐力。這些運動項目包括各類田徑跑，800米起，以及各類滑雪和自行車比賽。此外，健美出版物最近開始表明 EPO 可以替代大量使用合成代謝類固醇。 Epo 藥物與 stanazole、胰島素和生長激素 (HGH) 聯合使用。
促紅細胞生成素製劑是耐受性良好的藥劑，幾乎沒有副作用。然而，過量服用 EPO 和不受控制的使用會導致血液粘度增加，從而增加血液循環障礙的風險，直至外周血管血栓形成和肺栓塞，這通常會導致死亡。 EPO 的這些副作用的風險隨著在中山的訓練以及脫水而增加。
然而，有證據表明長期使用促紅細胞生成素製劑可能危害健康，有時甚至危及生命。特別是，由於大腦中的血液凝固和循環障礙，EPO 的使用與運動員的持續頭痛有關。此外，鐵代謝可能會受損：當肝臟中的鐵儲備相對較少時，身體對鐵的需求就會增加。注射外源性鐵後，開始在肝臟內沉積，20-25年後出現與鐵過量相關的肝硬化。
運動中的促紅細胞生成素
重組促紅細胞生成素在運動中的使用歷史（在科學文獻中通常稱為 rHuEPO、r-HuEPO、rhu-EPO、rEPO）可以追溯到 1977 年，當時首次以純化形式從人類尿液中分離出促紅細胞生成素。促紅細胞生成素在體育和比賽中作為禁用藥物的引入和控制分以下階段進行：
1985 - 克隆了EPO基因；
1987 - 重組促紅細胞生成素首次在歐洲上市；
1987-1990 年。 - 荷蘭和比利時騎自行車的人中有幾人死亡歸因於使用 EPO；
1988 - 國際滑雪聯合會將促紅細胞生成素列入興奮劑清單；
1989 - FDA（食品和藥物管理局） - 控制該國藥品生產和分銷的政府機構允許生產重組 EPO；
1990 - 國際奧委會禁止使用促紅細胞生成素；
1993-1994 年。 - 國際田聯在 M. Donika 教授的積極參與下，在八場世界杯比賽中介紹了採血程序；
1997 年 - 國際自行車聯盟和國際滑雪聯合會在比賽開始前批准了血液採樣程序，設定了血細胞比容和血紅蛋白的限制。雖然超過這些限制不是不合格的基礎，但它旨在保護運動員的身體免受與血紅蛋白和血細胞比容升高相關的潛在並發症；
1998 年 - 關於在環法自行車賽中使用促紅細胞生成素的報導得到了廣泛的媒體報導；
1999 - 為悉尼奧運會開發可靠的 EPO 檢測方法的研究得到加強。
由於天然和重組促紅細胞生成素具有幾乎相同的氨基酸結構，重組促紅細胞生成素與其生理類似物極難區分。
吸入氙氣在俄羅斯被積極用於刺激促紅細胞生成素的分泌。在 2014 年索契奧運會上，許多俄羅斯運動員在比賽開始前接受了氙氣吸入治療。自 2014 年 5 月以來，該方法已被反興奮劑機構禁止。
興奮劑控制
當前用於測定促紅細胞生成素的方法庫包括直接方法和間接方法。直接法是基於對通過基因工程獲得的天然內源性促紅細胞生成素和EPO研究中發現的那些微不足道的差異進行鑑定。特別是，一些研究人員試圖利用為兩種類型的 ELISA 分子建立的電荷分佈差異。基於這些差異，嘗試使用毛細管電泳方法分離兩種類型的分子。雖然這種分離原則上是可能的，但它需要大量的尿液（最多 1 升，這在實踐中是不可接受的，這是可以理解的）。
首選間接方法，它只需要少量的血液或尿液樣本。檢測 EPO 的間接方法的例子有：
樣品生物環境中與正常水平的偏差。這一事實意味著所確定的 EPO 水平過量應該不同於生理或病理變化。然而，只有當與外源性給藥後檢測到的值相比變化範圍足夠窄時，才可能使用該標準。後者只有在使用血液作為興奮劑檢測樣本時才有可能；
生化參數的註冊，其值取決於促紅細胞生成素的濃度。這種方法可能基於測量可溶性轉鐵蛋白受體 (sTfR) 的血清含量，其水平在引入重組 EPO 後增加。然而，在中山訓練後，類似的變化正在發生；
EPO給藥後尿液中纖維蛋白和纖維蛋白原分解產物的測定。
目前，幾乎不可能可靠地識別外源性促紅細胞生成素注射入體內的病例。因此，在引入 EPO 後檢測到的血液生理參數的變化被用於控制。因此，國際自行車聯盟使用最大血細胞比容值（男性為 50%）的標準。國際滑雪聯合會制定了血紅蛋白的最大允許值（女性為 165 克/升，男性為 185 克/升）和網織紅細胞水平不超過 0.2%。如果在賽前控製程序中超過這些限制，有關運動員將因健康原因被暫停比賽。但是，血紅蛋白和血細胞比容都是受多種因素影響的指標。特別是，即使在一次平均容量耐力訓練之後，這兩個指標也會發生顯著變化。此外，這些指標的特點是顯著的個體差異。因此，單次超過血細胞比容值的 50% 不能證明紅細胞生成素在運動中被濫用。
為了加強對使用促紅細胞生成素作為興奮劑的控制，世界反興奮劑機構引入了運動員血液護照的作案手法。血液護照是世界反興奮劑機構的開發項目之一，主要旨在檢測促紅細胞生成素及其類似物。它根據 30 個不同的指標為每個運動員生成一個單一的計算機血液學概況，首先是在那些需要耐力的運動中。瑞典、挪威、加拿大、德國等10個國家已經加入了血液認證項目的引進和完善。俄羅斯反興奮劑機構批准了這一舉措，但將在所有醫療和法律方面最終確定後實施。
WADA 建議使用 Sysmex（日本）或 ERMA 子公司對運動員的血表進行測試。這個品牌的最新一代全自動血液分析儀贏得了血細胞計數準確性的最高信心指數。
在強化訓練和專業體育活動中，需要不斷進行血液學分析，以確定紅細胞數量及其參數（體積、血紅蛋白飽和度）、血紅蛋白和血細胞比容水平。血細胞比容不應超過 50% - 這會導致血液增稠，這反過來又會導致肌肉和內臟血液循環惡化，增加血栓形成的風險（血栓形成傾向可以通過標記來評估） D-二聚體）。此外，需要完全控製鐵代謝（血清中的鐵濃度、總鐵結合力和不飽和鐵結合能力、鐵飽和百分比、轉鐵蛋白、鐵蛋白、C 反應蛋白）並確定葉酸和維生素 B12 水平。血液。所有這些化合物都是正常紅細胞生成所必需的，在體育活動中不應缺乏。除了上述測試外，還需要控制促紅細胞生成素本身的水平。
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